Nació en Palestrina, hija de Odón, de los Príncipes Colonna, y de Mabilia o Magdalena Orsini. Los años en los que vivió Margarita fueron tumultuosos y complicados para la Iglesia. La sede papal quedó vacante durante 20 años, el periodo más largo de la historia. Los pontificados de los papas que salían del cónclave eran demasiado breves, y eso perjudicaba su autoridad y prestigio, tan necesarios para mantener el equilibrio entre las pretensiones de Francia y del Imperio germano sobre el territorio italiano.
Desde la más tierna infancia había sido educada por su madre en las virtudes cristianas, que había conocido a san Francisco de Asís. Pero ella y sus hermanos quedaron pronto huérfanos, primero de padre, y luego de madre. Quedó bajo la tutela de su hermano Juan, dos veces senador de Roma, quien le preparó un matrimonio prestigioso y conveniente para las alianzas nobiliarias, mas ella sólo deseaba ser esposa virginal de Jesucristo. El 6 de marzo de 1273, apoyada por su otro hermano, el cardenal Giacomo Colonna, se retiró con otras dos jóvenes piadosas en la iglesia de Santa María de la Costa, en el Monte Prenestino, hoy llamado Castel San Pietro, encima de Palestrina, donde fundaron una comunidad religiosa, sin aprobación canónica. Vistió el sayo de las clarisas, bajo el cual llevaba un cilicio ceñido a sus carnes. Entre ayunos y penitencias pedía al Señor le concediese su mayor deseo: ser clarisa. Así vivió unos años, siendo un escándalo para su familia.
En 1278, siendo su hermano Juan senador de Roma, su otro hermano, Giacomo, fue nombrado cardenal por expreso deseo del papa Nicolás III. El joven Giacomo era un verdadero creyente y amaba a Cristo, de modo que tomó consigo a su hermana y la llevó a Roma, para orar juntos ante los sepulcros de san Pedro y san Pablo. Fue el comienzo de una nueva etapa en la vida de Margarita, pues su ejemplo despertó el interés de otras mujeres, interesadas en dedicar enteramente su vida, como ella, al servicio de Cristo.
Hacía sólo 20 años que había muerto santa Clara de Asís, y su ideal de vida y el de Francisco atraía a multitud de personas de toda condición social. A petición de Margarita, el ministro general de los frailes menores fray Jerónimo Masci, futuro papa Nicolás IV, le permitió entrar en el monasterio de santa Clara de Asís, pero los planes del Señor eran otros, y una enfermedad se lo impidió. Pensó entonces en retirarse con sus compañeras en el convento de la Méntola sobre el monte Guadagnolo, pero era un feudo del conde de Poli, que no veía con buenos ojos a una Colonna en su territorio. Fue por eso que, al poco tiempo, se trasladó a Roma, y pasó largo tiempo como huésped de una noble muy piadosa y generosa, llamada Altrudis, apodada "de los pobres" por aquellos a quienes ella había dado sus bienes. Hasta que, en 1278, con ayuda de su hermano cardenal, regresó al monte Prenestrino, junto a su ciudad natal, para fundar monasterio donde se viviera pobremente y se alabara al Señor día y noche.
Ella misma se ocupó de la formación de sus compañeras; pero su caridad se extendía más allá, hasta los enfermos y pobres de la comarca. Cada año, para la fiesta de San Juan Bautista, del que era muy devota, organizaba para ellos una comida. Toda su rica dote fue a parar a manos de los pobres y enfermos. Una vez agotado su rico patrimonio personal, no permitió que sus hermanos le ayudasen, sino que prefirió vivir como franciscana, y no le importó recurrir a la "Mesa del Señor", pidiendo limosna de puerta en puerta, para continuar su obra en favor de los pobres.
Practicó de manera heroica todas las virtudes, edificando al pueblo con la oración asidua y el ejemplo de una caridad heroica. Con ocasión de una epidemia, Margarita se hizo "toda para todos" asistiendo maternalmente a los hermanos enfermos y corrió también en ayuda de los franciscanos de Zagarolo. Otra vez acogió en casa a un leproso de Poli, comiendo y bebiendo en el mismo plato y, en un ímpetu de amor, besó aquellas repugnantes llagas. Sería demasiado prolijo recordar todas las manifestaciones de la intensa vida mística de Margarita: la observancia escrupulosa de la regla de Santa Clara, el amor a la pobreza, la continua unión con Dios, los éxtasis, las efusiones de lágrimas, las frecuentes visiones celestiales, el matrimonio místico con el Señor, quien se le apareció colocándole un anillo en el dedo y una corona de lirios sobre la cabeza y le imprimió la llaga del corazón.
Durante siete años sobrellevó pacientemente una herida ulcerosa en el costado, como si llevara una llaga de la pasión de Jesucristo. Aún no había cumplido los 30 años cuando murió a causa de la úlcera y de unas fiebres altísimas. Hoy sus reliquias se veneran en la iglesia de Castel San Pietro. Pío IX aprobó su culto el 17 de septiembre de 1847.
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