Estando en Lucca, estudiando el arte de la “especiería” (farmacia), formó parte de un grupo de jóvenes cristianos cuya misión principal era asegurarse una intensa vida cristiana a través de la oración, los sacramentos y la formación, como también asistiendo a los pobres y peregrinos. Este grupo se constituyó en congregación laical, conocida como los "Colombinos". Es justamente en este periodo que en más de una oportunidad piensa en la opción de consagrarse totalmente a Dios.
A sus 26 años ya ejercía su profesión de farmacéutico. Sin embargo, seguía sintiendo la llamada al sacerdocio. Es en este período, entonces, que asiente a la llamada de Dios y es su director espiritual quien lo orientó en los estudios eclesiásticos, dejando entonces la farmacia. Celebra su primera misa el 6 de enero de 1571.
Con la ayuda de los "Colombinos", impartía clases de religión y catequesis, y ante lo fructuoso de tal servicio, el obispo le confió la catequesis en todas las Iglesias de Lucca. Ante la imposibilidad de atender personalmente las demandas de los párrocos, escribió un folleto con la síntesis de la doctrina cristiana y el modo de enseñarla. De ahí surgió la fundación de la Compañía de la Doctrina Cristiana, formada por laicos y aprobada por el Papa Clemente VIII en 1604.
El 1° de septiembre de 1574, San Juan funda la Fraternidad de Sacerdotes Reformados de la Santísima Virgen, que tras su muerte adoptó el nombre de Orden de los Clérigos Regulares de la Madre de Dios. En 1584, el Papa Gregorio XIII confirmaba la Orden que en 1581 había aprobado el obispo de Lucca. Dicha Orden daba especial importancia a la obediencia, al camino de la santificación personal, el acompañamiento espiritual, la asistencia sacramental de los fieles y la penitencia.
En el año 1596, y bajo petición del Papa Clemente VIII, cumple el rol de “Reformador” y “Visitador Apostólico” de diversos monasterios y conventos. Anteriormente, había cumplido el rol de “Comisario Apostólico” en el Santuario de la Virgen del Arco, en las cercanías de Nápoles.
En 1603, Juan Leonardi, en colaboración con el español Juan Bautista Vives y el jesuita Martín de Funes, funda un centro de estudios misionales, que con el tiempo sería el Colegio Urbano de Propaganda Fide.
San Juan Leonardi muere en Roma el 09 de octubre de 1609, dejando dos casas de los clérigos de la Madre de Dios: una en Lucca y otra en Roma. Otras tres fueron abiertas en el siglo XVII. La regla definitiva de su comunidad no fue publicada hasta 1851.
Es el Papa Benedicto XV quien lo declara “Venerable” y Pío IX lo inscribe en el catálogo de los “Beatos”. En la Pascua de Resurrección de 1938, el Papa Pío XI, lo proclama “Santo”. Recientemente, el 08 de agosto de 2006, el Papa Benedicto XVI lo ha nombrado “Patrono de los Farmacéuticos”.
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